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プラスミド抽出 [2013/06/09 09:08] (現在)
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 +======プラスミド抽出======
 +大腸菌などの菌体を溶解し、プラスミドDNAを抽出する方法で、精製度は高くないが操作が簡便な抽出方法である。プラスミドや菌株にもよるが、培養液数1-2mLで数百ナノグラムスケールのプラスミドDNAが得られる。
 +
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 +  -プレートからコロニーを拾って、液体培地で一晩培養
 +  -培養液をチューブに移して遠心して回収。(1min at 4°C 15,000rpm)
 +  -0.2mLのSolIを加え、ボルテックスで分散。
 +  -0.4mLのSolIIを加え、軽く浸透して氷上でインキュベート。\\ (5minくらいたっても透明~半透明の溶液にならない場合は菌体量が多すぎる)
 +  -0.3mLのSolIIIで中和する。ここでDNAは溶解したままアルカリ性で溶けていた分子(タンパク質など)が凝集する。
 +  -遠心で不溶物を沈殿させる。(15min at 4°C 150,​000rpm)
 +  -上清を新しいチューブに移して[[RNase]]Aを2 μL添加して37°C 20minインキュベート。
 +  -[[フェノール・クロロホルム抽出]]
 +  -[[イソプロパノール沈殿]]
 +  -[[エタノール沈殿]]
 +
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 +=====溶液調製=====
 +====SolI====
 +^組成^量^目的^
 +^1M [[Tris-HClバッファー]](pH8.0)|5 mL| | 
 +^0.5M [[EDTA]]|4 mL|DNase活性の抑制|
 +<​chem>​H2O</​chem>​で200mLにメスアップ。
 +
 +グルコースは特に必要ない。細胞壁のペプチドグリカンを分解するために[[リゾチーム]]を添加したり、RNAを分解するために[[RNase]]を添加することもある。(酵素を加えない場合、単に菌体を洗って分散するためのバッファーと考えてよいでしょう)
 +
 +
 +====SolII====
 +^組成^量^目的^
 +^[[NaOH]]|1.6g|脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化、RNAの塩基触媒的加水分解|
 +^[[SDS]]|2g|脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化|
 +<​chem>​H2O</​chem>​で200mLにメスアップ。プラスチックボトルに保存。
 +
 +====SolIII====
 +^組成^量^目的^
 +^[[酢酸カリウム]]|58.9g|SolIのアルカリを中和|
 +^[[酢酸]]|24mL|SolIのアルカリを中和|
 +^<​chem>​H2O</​chem>​|106mL| |
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 +{{tag>​実験プロトコル}}