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ホスファターゼ [2013/06/09 09:08] (現在)
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 +======ホスファターゼ======
 + ​ホスファターゼは5'​末端のリン酸を脱リン酸化する。ホスファターゼ処理後は5'​はヒドロキシル末端となる。
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 +{{bio:​phospho_term5.png|}} + ホスファターゼ →
 +{{bio:​hydroxy_term5.png|}}
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 +=====BAPとCIAP=====
 +遺伝子工学用の試薬としては、CIAP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase)や、BAP(Bovine alkaline phosphatase)がよく用いられる。
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 +**BAP**
 +  -DNAを17μLのdd<​chem>​H2O</​chem>​に溶解
 +  -10xバッファー 2μL添加
 +  -BAP 1μL添加
 +  -**60-65℃**,​ 1 hr インキュベート
 +  -[[フェノール・クロロホルム抽出|フェノクロ抽出]] x 2
 +  -[[エタノール沈殿]]
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 +**CIAP**
 +  -DNAを17μLのdd<​chem>​H2O</​chem>​に溶解
 +  -10xバッファー 2μL添加
 +  -CIAP 1μL添加
 +  -**37℃**, 30min インキュベート\\ (あるいは、**37℃**,​ 15min → **50℃**, 15min)
 +  -[[フェノール・クロロホルム抽出|フェノクロ抽出]]
 +  -[[エタノール沈殿]]
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 +=====メモ=====
 +  *ライゲーション時にクローニングベクターの自己環状化を抑制することができる。
 +  *基質として[[ADP]]を用い、[[キナーゼ]]を用いても脱リン酸化は可能。
 +  *ホスファターゼの不活性化は難しく、実際の実験ではホスファターゼ処理後、[[フェノール・クロロホルム抽出]]が推奨されている。
 +  *5'​末端に放射性ラベル処理する前にホスファターゼを用いることもある。
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 +{{tag>​酵素 実験プロトコル}}